蛋白酶和淀粉酶活性检测方法探讨
www.xbxmw.com 2007-6-24 19:38:07 来源： 阅读：次
' 1.3.2 样品酶活的测定
精确称取酶粉5g，充分碾细,加去离子水100mL，在40℃水浴中搅拌30min，充分溶出酶蛋白，然后过滤，留滤液待测。取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L
TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmL pH
7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温1Omin后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温2Omin，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5nL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长66Onm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
管号 标准酪氨酸 去离子水 Na2CO3 福林一酚试剂 酪氨酸含量
(100μg/mL)(mL) (mL) (0.4mol/L)(mL) (mL) (μg/mL)
1 0 1.0 5 1 0
2 0.2 0.8 5 1 20
3 0.4 0.6 5 1 40
4 0.6 0.4 5 1 60
5 0.8 0.2 5 1 80
6 1.0 0 5 1 100
1.4 蛋白酶活力计算
蛋白酶活力，Ax4xN/l0。
式中:A:对照标准曲线得出的酪氨酸释放量；4:4机反应液取出1mL；N:酶粉的稀释倍数；10:反应时间1Omin；蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
2 淀粉酶活力的测定
测定淀粉酶活力的方法有4类，一是测定底物淀粉的消耗量，有粘度法、浊度法和碘-淀粉比色法等；二为生糖法，测定产物葡萄糖的生成量；三为色原底物分解法，四是酶偶联法。其中碘-淀粉比色法测淀粉酶活力操作简便迅速、实用。
2.1 原理
碘-淀粉比色法淀粉经α-淀粉酶催化水解，生成产物为葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物淀粉浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与末被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较成比例，从而计算出淀粉的量，推算肘淀粉酶活力。
2.2 试剂
2.21 底物缓冲液
精确称，取9.0g；氯化钠；22。6g无水磷酸二钠和12.5g无水磷酸二氢钾，置于约500mL去离子水中力口热至沸腾溶解。称取0.4g可溶性淀粉于一小烧杯中，加入10mL去离子水，使其混悬后加人上述沸腾溶液中，冷却至室温后加入5mL37%甲醛溶液，用去离子水稀释至1000mL。此即为pH7.0、酶底物淀粉浓度为0.4g/L的缓冲液。
| 上一篇：饲料添加剂使用要慎重 下一篇：前景看好的甜味剂——果葡糖浆 |
