免疫酶组化法对试验感染雏鸭体内鸭肝炎病毒的分布测定

www.xbxmw.com　　2008-4-15 22:25:01　　来源：　　 阅读：次
鸭病毒性肝炎（Duck Virus Hepatitis，DVH）是雏鸭的一种传播迅速、病程短和高度致死性的传染病，主要病变是肝脏肿大和肝脏表面有出血点或出血斑。本病自1945年Levine和Hofstad发现以来，现已呈世界性分布。本试验以鼠抗DHV抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测石蜡切片中DHV抗原的免疫酶组化法，并以此对人工感染雏鸭不同组织器官中的DHV精确定位和分布测定，为探讨鸭病毒性肝炎致病机理研究提供依据。

    1 材料与方法　

    1．1 实验动物　 雏鸭为购自合肥市某种鸭场DVH阴性的1日龄樱桃谷肉鸭，出壳后未接种任何疫苗，隔离饲养观察两天，无异常。6周龄雌性BALB/C小鼠由扬州大学实验动物教研室提供。

    1．2　病毒 R85952为本研究室保存的I型DHV标准强毒株，其毒价为104.8LD50/0.1 ml。试验前接种雏鸭进行毒株复壮，取肝毒用生理盐水按1∶10稀释研磨冻融3次，经3 000 r/min离心15 min，取上清液加入青霉素、链霉素各1 000 IU(μg)/ml，置37℃温箱中作用1 h备用。

    1．3　鼠抗DHV A66株高免血清的制备将DHV A66株按文献的方法进行纯化、测定蛋白质浓度，并按文献制备单抗的程序免疫BALB/C小鼠、分离血清、检测抗体滴度。

    1．4　试验用血清和酶标抗体　正常BALB/C小鼠血清由安徽省医学科学研究所病毒室提供；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品。　

    1．5　 检测石蜡切片中DHV的免疫酶组化技术的建立

    1．5．1 待检组织石蜡切片的制备 按文献［4］的方法略加改进。取待检组织块置10%中性福尔马固定，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每份样品制备3～5 μm厚的蜡片2张以上，分别供免疫酶复染和常规H.E.染色，浸蜡和烘片过程控制在60℃以下。

    1．5．2　免疫酶组化技术的程序及结果判定　切片按文献［4］的程序进行免疫酶组化染色，以Harris苏木素进行衬托染色、凉干、封片后镜检。凡被检组织局部细胞胞浆内呈现棕黄色的判为阳性（+），否则判为阴性（-）。

    1．5．3　鼠源高免血清和酶标抗体工作浓度的确定　 取人工感染DHV R85952株雏鸭典型病变的肝脏制成石蜡切片作为阳性切片，将高免血清分别作1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、稀释，HRP标记的羊抗鼠IgG分别作1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000稀释，进行方阵染色观察，确定最佳工作浓度。

    1．5．4　特异性试验　用上述感染DHV R85952株肝脏切片作为阳性抗原，并设DHV阴性雏鸭肝脏切片作阴性对照，以生理盐水、正常BALB/C小鼠血清代替鼠抗DHV阳性血清，酶标抗体为二抗，进行免疫酶组化染色。

    1．5．5　阻断性试验　以1 000、2 000、4 000、8 000 EID50/ml的DHV A66

    株尿囊液和不含病毒的正常鸡胚尿囊液分别与工作浓度的高免血清等量混合，37℃作用1h后替代工作浓度的高免血清作为一抗，与阳性肝脏切片进行组化染色。

    1．6　试验感染雏鸭组织中DHV的检测　 300只3日龄雏鸭随机分成2组，对照组60只，试验组240只，分别隔离饲养。试验组每只皮下注射病毒上清液0.2 ml，观察和记录攻毒后临床表现和死亡情况。于攻毒后6 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h分别扑杀6只试验组和3只对照组雏鸭，取其肝、脾、脑、心、肺、肾、胰、小肠等组织块，置10%中性福尔马林中固定制成石蜡切片，检测DHV。

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