对虾白斑综合症病毒检测技术概述

www.xbxmw.com　　2008-10-10 21:57:22　　　　
对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，wssv）病是全世界范围内对养殖对虾危害最大的病毒病。迄今为止，学者们对引起该病的病毒命名尚不统一，有白斑杆状病毒（WhiteSpotBac-ulovirus，WSBV）、皮下及造血组织坏死病杆状病毒（HepodermalandHematopoietieNecroisisBacu-lovirus，HHNBV）、日本对虾杆状病毒（Rod-shapednuclearVirusofPenacusJaponicus，RV-PJ）和系统外胚层和中胚层杆状病毒（SystemicEc- todermal and Mesoderrnal Baculovirus，SEMBV）等。所有这些病毒均被认为属于杆状病毒科的无包涵体杆状病毒亚群。在第六次国际病毒分类会议 （ICTV）报告中取消了以上命名，具体命名待定，按照Lightener的意见将其暂时命名为白斑综合症病毒（wssv）。我国自1993年暴发此病以来，每年都发生对虾大规模毁灭性死亡，几乎所有养殖虾类皆可被其感染。WSSV毒力较强，3～10天内被浸染者的累积死亡率达100.0%。世界动物卫生组织（OIE）2000年将其列为“需要作报告的疾病之一”。鉴于WSSV尚未有有效的治疗方法，快速准确的病原分离检测技术已成为研究的焦点之一。本文就对虾白斑综合症病毒（wssv）的检测技术作一综述，以供参考。

    

    1直接观察法

    

    直接观察法是根据养殖过程中对虾急性和慢性死亡的情况，对照白斑综合症的典型症状作出判断。如头胸甲出现白斑、甲壳变软易剥离等，这种方法主要是根据实践经验判断，且必须是对虾感染病毒致死后才能发现。

    

    2组织化学法与电子显微镜技术

    

    组织化学法是取对虾的各种组织用适当的染色技术在光镜下进行检测。主要有H-E染色和T-E染色等。莫照兰等（2000）曾用H-E染色感染 WSSV病毒的螯虾的鳃和胃组织，在光镜下观察病变组织与对照组呈现差异显著，组织结构松散残缺呈坏死状态。黄傻等首创一种用于现场诊断的T-E染色方法，整个检测过程只需要10分钟左右，具有快捷、简单、方便等优点，但是，这种方法对操作技术要求高，而且由于对虾可能终生带毒而不发病，因此，即使检测到病毒也不能确认一定会发病。相对而言电子显微镜观察更为准确，可直接观察到病毒的形态和大小。吴友吕等（1995）曾用电镜在对虾体内检测到WSSV。姜明等（1996）对中国对虾在病害暴发期间病虾肝胰脏、鳃、肾和肠组织进行固定切片，在透射电镜虾观察到杆状病毒的3种存在形态。莫照兰等（2002）对螯虾人工感染WSSV病毒并取鳃和胃用固定液固定，制成超薄切片在电镜下观察到WSSV的病毒粒子。谢数涛等（2000）纯化WSSV病毒并负染后在电镜下观察发现病毒的精细结构。Nunan等（1998）和Zhan等（1998）也曾对对虾人工感染WSSV进行了电子显微镜观察。组织化学与电子显微镜技术都是在病毒大量增殖后才能观察到，当感染早期或处于潜伏期病毒量小时，则难以观察到。

    

    3免疫学检测技术

    

    免疫学检测技术是根据抗原抗体反应建立的，方法多种多样，主要用于快速鉴定。单克隆抗体和多克隆抗体的制备是进行检测的必需工作。单克隆抗体技术是随着杂交瘤细胞建立而发展起来的，可以产生对特异决定簇的特异抗体。优点是制备抗体时抗原不需高度纯化、特异性强；缺点是制备繁琐、试验条件严格、易漏检。多克隆抗体来源于抗血清，含所有抗原决定簇的抗体，易发生交叉反应，出现假阳性，特异性不强，一般不用于对虾病毒的检测。

    

    对虾病毒的检测一般采用单克隆抗体，常用酶联免疫吸附分析（EIJSA）实验。酶联免疫吸附分析是目前发展最快的免疫标记技术，具有灵敏、快速、易操作、可定量等优点，应用广泛。于佳等（1995）将 WSSV病毒注射小鼠，用免疫后的脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞融合，筛选出了可用于WSSV检测的单克隆抗体。黄倢等（1995）用单克隆ELISA技术提前20～40天对对虾发病的可能性做出预报。涂小林等（1995）用纯化的对虾病毒免疫新西兰兔获得多克隆抗体，建立了病毒的间接ELlSA检测技术，可在6小时内完成对样品的检测，灵敏度可达60ng水平。史成银等（1999）认为以脱脂奶粉作封闭剂的快速间接ELISA方法具有大大缩短检测时间，提高检测灵敏度降低或消除酶标板“边缘效应”、降低检测成本等优点，在对虾病毒检测的实验室研究和生产实践上都具有广泛的应用前景。汪岷等（2000）用纯化的WSSV免疫新西兰兔获得纯化的IgG多克隆抗体，建立了双抗体夹心法直接ELISA检测方法，6小时左右即可完成检测。朱建中等（2002）建立了WSSV单抗介导间接ELISA，不仅能快速检测病毒，还可用于检测WSSV在对虾动物模型体内的动态分布，为研究WSSV在螯虾体内的感染机理提供了手段。高宏等（2002）利用病毒细胞与宿主细胞亲和吸附这一特性建立了新的筛选中和抗体的方法，可在缺少细胞系的情况下成功筛选中和抗体。

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