对虾白斑综合症病毒检测技术概述

www.xbxmw.com　　2008-10-10 21:57:22　　　　

    

    Ponlos等（1994）制备了对虾WSSV病毒的 IgM型单克隆抗体，检测新鲜对虾时存在非特异性反应，需将新鲜样品冻存较长一段时间才能消除非特异性反应。Lightner等（1998）用WSSV单克隆抗体进行ELISA检测对虾时也出现上述问题。Hameed等（1998）用硝化纤维素酶免疫印迹法（NC-EIB）检测WSSV感染斑节对虾，发现在对虾淋巴、眼柄、鳃、头部软组织、腹肌和肝胰脏都存在WSSV。Zhan等（1999）制备了WSSV的单克隆抗体在中国对虾体内检测到了WSSV。

    

    4分子生物学技术

    

    4.1核酸探针（DNAProbe）技术

    

    核酸探针技术又名基因探针或核酸分子杂交技术，其原理是两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列就能够特异结合成为分子杂交链。因此，在已知的DNA片段上加上可识别的标记，成为探针来检测未知样品中是否具有与已知序列相同的序列，并判断其与已知序列的同源程度。核酸探针具有敏感性高（可测出10E-9～10E-12的核酸）、特异性强等优点，易成功地用于多种疾病的诊断。在对虾 WSSV病毒的检测上，张岩等（1995）用Pub18构建了对虾WSSV的DNA重组质粒，提取后经斑点杂交和酶切分析，证明质粒中插入的片段为病毒DNA。刘萍等（1995）从纯化的病毒中提取DNA，用限制性内切酶酶切并组装到Puc18质粒上，建立了WSSVDNA文库，从中筛选出3个重组质粒，用光敏生物标记成探针检测染毒对虾效果很好。石正丽等（1998）从中国对虾病虾中分离到一种杆状病毒，在重组质粒中取2个克隆与WSSV基因片段制成探针检测我国沿海地区中国对虾杆状病毒的同源性。邓敏等（2000）通过分离纯化WSSV部分基因组文库，将制备的探针进行Southern杂交、打点杂交和原位杂交，结果证明克隆片段对WSSV特异，可用于WSSV检测。常青山等（2000）从中国对虾杆状病毒核酸随机文库中筛选出4个片段用地高辛标记作为探针进行斑点杂交检测对虾杆状病毒，实验表明中国对虾杆状病毒存在垂直传播的可能性。Lo等在检测野生斑节对虾WSSV时也发现该病毒存在垂直传播的可能性。黄灿华等（2000）首先用地高辛标记的WSSV核酸探针动态研究其在对虾体内的侵染过程，对虾摄取感染WSSV的食物，经消化道上皮细胞进入虾体，伴随淋巴循环进而侵染其它靶组织，直至对虾发病死亡。吕玲等（2000）用WSSV核酸探针原位杂交（1SH）检测对虾，发现对虾的不同组织对病毒具有特异性，并比较了ISH与H-E两种检测方法，结果ISH比H-E染色更准确、敏感。朱建中等（2001）用核酸探针斑点杂交方法研究了WSSV青岛株在螯虾体内的动态分布，表明病毒在对虾和螯虾体内感染机理具有相似性。Lo等（1999）、Chang等用此技术检测WSSV，但不是用PCR扩增基因片段得到核酸探针的。Nunan等和徐洪涛等以从感染对虾中纯化的WSSV为模板进行PCR扩增，然后用DIG标记扩增产物而得到探针。雷质文等（2001）用PCR成功制备了DIG标记探针，用于检测对虾WSSV，证实了白对虾时WSSV的天然宿主。该法比常规方法快速，特异性、敏感性和可重复性均较高，可作为对虾暴发病的诊断、抗特定病原对虾的选育、出入境对虾及对虾产品的检疫方法，目前已制备成试剂盒。宋晓玲等（2001）用DNA斑点杂交检测对虾及其饲料和环境生物，发现对虾主要饵料及环境生物类群均可检出WSSV，为了解对虾WSSV的感染途径提供了依据。莫照兰等（2002）用地高辛标记的核酸探针检测WSSV人工感染的淡水克氏原螯虾，结果表明对虾WSSV克感染淡水克氏原螯虾，病毒核酸原位杂交检测敏感特异。

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