对虾白斑综合症病毒检测技术概述

www.xbxmw.com　　2008-10-10 21:57:22　　　　

    

    4.2PCR技术

    

    聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是一种可在体内将特异性DNA序列进行高效扩增的技术，与传统诊断方法相比，它具有敏感性及特异性高，简单、快速等优点，已广泛应用于WSSV的检测。汪岷等（1998）用台湾WSSV的引物，对中国对虾杆状病毒进行PCR检测，结果表明中国对虾杆状病毒与台湾WSSV的同源性达98.7%，该PCR引物可用于对虾杆状病毒的检测。刘萍等（1999）采用PCR检测方法对人工感染亲虾的胃、鳃、卵巢、卵和各期幼体进行跟踪检测，认为WSSV难以从卵直接向幼体进行传播。战文斌等 （2000）通过PCR技术检测中国对虾WSSV，认为存在由亲虾传播给虾苗的感染途径。（2000）应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、中、后期的对虾样品进行检测，结果表明PCR可快速灵敏准确的检测WSSV、对病毒的早期诊断和健康对虾的选育提供依据。谢数涛等（2000）通过对WSSV基因测序设计PCR引物，建立了对虾WSSV的PCR检测方法。上海生化所已研制成中国对虾杆状病毒 PCR诊断试剂盒，灵敏度达0.125ng，在上海、浙江等地应用时具有特异性。

    

    为使检测结果更快速更准确，一些学者对PCR技术做了不同改进。吕玲等（2000）用改进的煮沸法提取WSSV病毒DNA，再进行PCR扩增，节省了检测时间（仅需4小时）且敏感性更高特异性更强，并认为附肢和肌肉是PCR检测的合适部位。章晓波等（2000）将对虾WSSV的一段特异性DNA设计成分子信标探针，用于该病毒的PCR检测，结果显示分子信标不影响PCR扩增且具有较高的特异性。夏春等（2000）根据对虾WSSV基因序列设计了4个多重PCR法用引物，建立了多重PCR检测WSSV的方法，通过优化反应条件，可从阳性感染的中国对虾fg级DNA中定性检测WSSV。谢数涛等（2001）利用套式PCR检测对虾WSSV，结果显示其灵敏度大约为一步PCR的10E4倍。庞耀珊等（2003）设计了一对WSSV的特异性引物，建立了快速检测WSSV的二温式PCR，最低可检测到1.0pg的WSSV总DNA，该PCR具有高度特异性和敏感性，可用于WSSV感染初期或潜伏期的亲虾和虾苗的检测和环境监测。

    

    综上所述，对虾WSSV的检测技术从最初依靠组织病理学和透射电镜观察到免疫学方法、DNA杂交和PCR技术，灵敏度、特异性和重复性都有了很大提高，检测结果更加快速准确。一般PCR比DNA杂交，荧光标记比酶联免疫标记灵敏，由于条件限制，PCR常用于实验室操作，荧光免疫需特殊仪器，因此DNA杂交和酶联免疫应用较多。为了提高检测的灵敏度，弥补单一检测方法的不足，可采用多种方法结合使用。如制备DNA探针时，利用PCR扩增使探针量增加，DNA杂交与ELISA结合使用，再用酶标记探针的方法，PCR技术与DNA杂交结合使用，用DNA杂交检测PCR产生的结果，荧光标记用于PCR产物的检测，使结果更直观。总之，随着检测方法的不断改进，对虾WSSV的检测将更快速、简便、灵敏、特异。

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